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泛素连接酶RNFX影响成骨样细胞MC3T3E1分化的研究
作者:周颖[1] 侯树勋[1] 衷鸿宾[1] 张春丽[1] 
单位:解放军总医院第一附属医院(304医院)[1]  
文章号:W091072  
2013/8/13 20:56:29    
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目的 克隆泛素连接酶基因RNFX,将其构建到真核表达载体,了解它在真核细胞中的表达、定位及对小鼠成骨样细胞MC3T3E1分化的影响,为进一步的功能研究提供基础。

目的 克隆泛素连接酶基因RNFX,将其构建到真核表达载体,了解它在真核细胞中的表达、定位及对小鼠成骨样细胞MC3T3E1分化的影响,为进一步的功能研究提供基础。

方法 提取人胚肾细胞HEK293TRNA,反转录获得cDNA模板,合成序列特异性引物后,采用RT-PCR方法获得RNFX的开放读框序列,克隆至pGEMT载体。经测序后分别改构至真核表达载体pCMV-MycpEGFP-N1,构建带MycGFP标签的真核表达载体pCMV-Myc-RNFXpEGFP-N1-RNFX,分别转染至小鼠成骨样细胞MC3T3E1中,采用蛋白印迹和免疫荧光方法检测该蛋白在细胞中的表达及定位情况。将Myc-RNFX和空载体分别转染至MC3T3E1细胞,以10mMβ-甘油磷酸钠和50μgml抗坏血酸诱导MC3T3-E1细胞分化成熟,在第3天时,用硝基四氮唑蓝/5--4--3-吲哚基磷酸(NBT/BCIP)显色方法定性检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,观察RNFXMC3T3E1细胞分化的影响。

结果 序列分析表明克隆的RNFX序列与GenBank报道的序列一致。脂质体转染入HEK293T细胞中,用anti-Myc抗体检测到目的蛋白Myc-RNFX的表达,分子量大小为21kD,与预期一致。荧光蛋白表达分析发现RNFX蛋白主要分布在细胞质膜附近。与空载体对照组相比,转染RNFX组细胞碱性磷酸酶染色阳性率明显增加,表明RNFX过表达可以促进成骨样细胞分化。

结论 RNFX真核表达载体构建成功,并在真核细胞中得到了正确表达。初步实验表明RNFX过表达可以促进成骨样细胞分化。我们的研究结果表明RNFX可能是一个在细胞质膜附近发挥作用的、潜在的调控MSCs自我更新/成骨分化的分子开关。

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作者简介
周颖
单位:解放军总医院第一附属医院(304医院)
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